In situ hibridizaciis diagnostikuri SesaZleblobebi

Presentation on theme: "In situ hibridizaciis diagnostikuri SesaZleblobebi"— Presentation transcript:

1 In situ hibridizaciis diagnostikuri SesaZleblobebi
prof. g. burkaZe

2 upiratesoba molekuluri biologiis meTodebTan SedarebiT
ISH-is principi: SesaZlebelia nebismieri genis (birTvSi) an m-rnm-is (citoplazmaSi) aslis gamovlena. gamosakvlev masalaSi nukleinis mJavebi ganicdis denaturacias (orZafiani dnm xdeba erTZafiani) da ukavSirdeba komplementuri Tanmimdevrobis Semcvel moniSnul zonds. Sedegad warmoiqmneba orZafiani hibriduli molekula (dnm:dnm, dnm:rnm an rnm:rnm).

3 sakvlevi masala ISH-Tvis:
1. citologiuri masala 2. parafinis anaTlebi 3. gayinuli anaTlebi 4. eqstragirebuli dnm

4 In situ hibridizaciis meTodika
1. fiqsacia/preparireba: fiqsatorebi: 1. precipitaciis gamomwvevi _ eTanoli, ZmarmJava. precipitaciis gamomwvevi fiqsatorebis gamoyenebisas moniSnuli zondebi qsovilSi advilad aRwevs, magram SeiZleba gamoiwvion rnm-is raodenobis Semcireba da qsovilis araoptimaluri morfologia.

5 2. jvaredinad damakavSirebeli _ 1-4% paraformaldehidi, 10% neitraluri buferuli formalde-hidi, glutaraldehidi. fiqsacia xdeba 0–4C-ze endogenuri ribonukleazebis inhibiciis mizniT, maqsimalurad swrafad (30 wuTSi). preparireba gulisxmobs citologiuri masalis sasagne minaze ganTavsebas, histologiuri masalis parafinSi Cayalibebas, gayinul anaTlebs, eqstragirebul dnm-s.

6 2. SeRwevadoba formalinSi fiqsacia amcirebs reaqtivebis SeRwevadobas ujredebSi, risTvisac gamoiyeneba SeRwevadobis gamaZlierebeli mravali reaqtivi, mag., HCl da sxvadasxva tipis proteinazebi.

7 3. hibridizacia sakvlev masalaSi jer xdeba nukleinis mJavebis denaturacia, ris Sedegadac orZafiani dnm xdeba erTZafiani, Semdeg ki xdeba hibridizacia. hibridizacia gulisxmobs denaturaciis Semdeg samizne nukleotidebis Tanmimdevrobis gawyvilebas moniS-nuli dnm- an rnm-zondebSi Semavali nukleotidebis TanmimdevrobasTan, anu isev warmoiqmneba orZafiani molekula: dnm:dnm, dnm:rnm, rnm:rnm.

8

9 zondis SerCeva zondebis SeqmnisTvis gamoiyeneba: ·  klonirebuli dnm. ·  genomuri dnm. ·  sortirebuli qromosomebi. ·  PCR-iT amplificirebuli dnm. ·  sinTezuri oligonukleotidebi. ·  gameorebadi dnm-Tanmimdevrobebi. ·  ribozondebi (rnm-zondebi).  

10 zondis tipebi: 1. orZafiani komplementuri dnm (cDNA). 2. erTZafiani cDNA. 3. rnm zondi (ribozondi). 4. oligonukleotidebi. yvelaze xSirad gamoiyeneba orZafiani zondebi, magram Tu saWiroa maRali mgrZnobeloba, maSin gamoiyeneba erTZafiani zondebi.

11 moniSvnis SerCeva moniSvnis SerCevis ori varianti arsebobs: 1. radioaqtiuri moniSvna (33P, 35S, 3H) 2. araradioaqtiuri moniSvna

12 radioaqtiuri moniSvnis upiratesobani:
·  maRali mgrZnobeloba. ·  zondiT moniSvnis efeqturobis advilad kontroli. · radioizotopebis inkorporacia advilia dnm-Si da rnm-Si mravali enzimebis saSualebiT. ·  SesaZlebelia naxevradraodenobrivi Sefaseba. uaryofiTi mxareebi: 1. radioaqtiuri narCenebis zemoqmedeba. 2. SeRebvis arastabiluroba. 4. vizualizaciis siCqare. 5. SedarebiTi siZvire.

13 2. araradioaqtiuri moniSvna haptenebiT (mag
2. araradioaqtiuri moniSvna haptenebiT (mag., biotini, digoqsigenini, fluoresceini, rodamini) fluoresceini (mwvane), rodamini (wiTeli), DAPI – 4`6-diamidino-2-fenilinindoli (lurji)

14 upiratesobani: ·   zondis stabiluroba. ·   usafrTxoeba. ·   swrafi gamovlena. ·   mravlobiTi erTdrouli moniSvna. ·   signalis amplifikacia. ·   SedarebiT dabali fasi. ·   maRali garCevisunarianoba. ·   imunohistoqimiasTan erTad gamoyeneba. uaryofiTi mxareebi: ·   hibridizaciis efeqturobis Semcireba. ·   dabali mgrZnobeloba.

15 4. amplificirebuli produqtis gamovlena _ vizualizacia
hibridizaciis Semdeg miRebuli hibriduli nukleinis mJavebis gamovlenis gza damokidebulia gamoyenebuli zondebis moniSvnis meTodze, anu arsebobs radioaqti-uri da araradioaqtiuri vizualizaciis sistemebi. araradioaqtiuri sistemebi ufro usafrTxo da swrafia, radioaqtiuri sistemebi ki ufro mgrZnobiarea. DAPI-iT moniSnuli qromosomebis kariotipireba

16 fluorescenciis Sefaseba gamosaxulebis analizis kompiuteruli sistemiT
B-CLL. interfazuli FISH: 4-alfa-satelituri Tanmimdevroba wiTelia, 12-alfa-satelituri Tanmimdevroba mwvanea.

17 FISH yvelaze farTod gavrcelebulia fluorescentuli in situ hibridizacia (FISH). FISH pirdapir avlens dnm-is an rnm-is specifikur regions ujredSi. am mizniT gamoiyeneba fluoresceiniT moniSnuli komplementuri zondebi. samizne SeiZleba iyos qromosomebi, interfa-zuli birTvebi an bioptati. fluorescentuli signalebi

18 FISH-is upiratesoba da uaryofiTi mxareebi:
· swrafi da mgrZnobiarea ·  ujreduli kultura saWiro ar aris. · Sedegebis interpretacia ufro advilia, vidre kariotipirebis dros. ·  SesaZloa kombinacia imunohistoqimiasTan. · iZleva informacias mxolod gamoyenebuli zondebis Sesaxeb, sxva aberaciebi ar vlindeba.

19 FISH meTodi metafazur da interfazul ujredebSi
FISH meTodi metafazur da interfazul ujredebSi. normalur interfazul ujredSi aRiniSneba 2 mwvane laqa (BCL-1) da 2 wiTeli laqa (IgH). anomalur interfazul ujredSi aRiniSneba 3 mwvane da 2 wiTeli laqa, magram unda iyos 1 wiTeli da 1 mwvane laqa.

20 t(11;14)(q13;q32) translokacia (naCvenebia isriT) inter-fazul birTvSi, mantiis zonidan ganviTarebuli limfoma. Bcl-1-is (11q13) zondi moniSnulia biotiniT da gamovlenilia avidin-FITC-iT. IgH-is (14q32) zondi moniSnulia digoqsigeniniT da gamovlenilia misi sawinaaRmdego rodaminiT.

21 mikrodeleciis sindromebis diagnostika FISH-iT
,,katis knavilis" sindromi (5p.15.2 delecia) Miller-Dieker-is sindromi (17p13.3 delecia) Smith-Magenis-is sindromi (17p.11.2) steroiduli sulfatazas (arilsulfatazas) deficiti (X-Tan SeWiduli iqTiozi) (Xp22.32) · DiGeorge-is sindromi (22q.11)

22 sarZeve jirkvlis karcinoma, HER-2, IHC, FISH

23 HER-2-is amplifikacia TOPA2-is delecia

24 me-4 qromosomis mikrodelecia, FISH

25 BCR/ABL translokacia, Zvlis tvinis nacxi, qronikuli mieloleikemia

26 DiGeorge-is sindromi, 22-e qromosomis mikrodelecia

27 FISH ormagi moniSvniT:
gamoiyeneba ori moniSnuli rnm-zondi an rnm zondebis da cilebis sawinaaRmdego antisxeulebis kombinacia. gamoiyeneba fluoresceiniT da digoqsige-niniT moniSnuli rnm. vizualizacia xdeba ori feris safuZvelze, mgrZnobeloba maRalia. embrioni ormagi moniSvniT: fluoresceini (mwvane) da digoqsigenini (wiTeli)

28 xuTferiani FISH

29 eqvsferiani FISH

30 qromogenuli in situ hibridizacia (CISH)
dReisaTvis TandaTan ufro farTod gamoiyeneba SedarebiT axali qromogenuli vizualizaciis sistema. am dros zondebis moniSvna xdeba biotiniT, substrati diaminobenzidini an tute fosfataza, anu igive, rac imunohistoqimiis dros. me-17 qromosomis specifikuri alfa-satelituri Tanmimdevroba

31 nazofaringeuli karcinoma, EBV, CISH

32 EGFR-is amplifikacia kisris regionis rbili qsovilis simsivneSi, CISH

33 SedarebiTi genomuri hibridizacia
(Comparative Genomic Hybridisation – CGH) upiratesoba da uaryofiTi mxareebi: mTeli genomis analizi erT gamokvlevaSi. saWiro ar aris metafazuri ujredebi. SesaZlebelia mcire raodenobiT ujredebis da dnm-is ( ng) gamoyeneba. SeiZleba arqivis masalis gamokvlevac.

34 CGH avlens amplifikaciis da deleciis yvela regions genomSi.
CGH-is dros moniSnuli qromosomebis kariotipis gansazRvra xdeba mwvane da wiTeli fluorescenciis safuZvelze. Sefaseba xdeba gamosaxulebis analizis sistemiT. amplifikaciis dros Warbobs mwvane, deleciis dros wiTeli.

35 CGH “sky”

36 In situ hibridizaciis gamoyeneba
1. virusuli infeqciebis gamovlena. 2. genis Tanmimdevrobis gansazRvra qromosomaSi. 3. genis eqspresiis lokalizaciis gansazRvra _ gansakuTrebiT mniSvnelovania paTologiur procesSi ama Tu im genis rolis gamovlenisaTvis. 4. transkripciis qsoviluri ganawilebis analizi. 5. specifikuri m-rnm-is sinTezis cvlilebaTa gamovlena.

37 In situ hiridizaciis upiratesobani:
1. genis zusti anatomiuri lokalizaciis gansazRvra da maRali mgrZnobeloba. 2. formalinSi dafiqsirebuli, parafinSi Cayalibe-buli masalis (maT Soris, arqivis masalis) gamoyeneba. 3. gamoiyeneba sxvadasxva vizualizaciis sistema, rac iZleva nukleinis mJavebis erTdrouli gamovlenis saSualebas. 4. misi kombinacia SesaZlebelia imunohistoqimiasTan, ris Sedegadac erTdroulad vlindeba sinTezirebuli cilovani produqti da Sesabamisi m-rnm an dnm da Sesabamisi ujredebis fenotipi.

38 5. am meTodiT konkretuli m-rnm-is gamovlena asaxavs genis transkripciis da m-rnm-is cvlis inten-sivobas, radgan m-rnm-is done ar aris damokidebuli peptidis transportze, sekreciaze da/an daSlaze. 6. In situ dnm-is gamovlenis upiratesoba isaa, rom SesaZlebelia qromosomebis fizikuri rukis Sedgena, qromosomebis struqturis analizi, dnm Tanmimdevro-bebis SefardebiTi ganawilebis gansazRvra mitozis da meiozis dros, anomaluri dnm-is struqturis gansazRvra paTologiis dros. 7. In situ rnm-is gamovlenis upiratesoba isaa, rom SesaZlebelia genebis SefardebiTi da droebiTi eqspresiis gansazRvra.

39 In situ hibridizaciis mgrZnobeloba
In situ hibridizaciis mgrZnobeloba damokidebulia vizualizaciis sistemis mgrZnobelobaze, hibridizaciis pirobebis optimumze da araspecifikuri fonis xarisxze. meTodis mgrZnobelobas gansazRvravs is faqti, rom erT konkretul ujredSi unda iyos m-rnm-is an dnm-is asli mainc. am problemis mosaxsnelad SeiZleba misi kombinacia PCR-Tan, gansakuTrebiT, virusuli dnm-is gamovlenisas.

40 In situ hibridizacia / RT-PCR
ISH RT-PCR mgrZnobeloba maRali Zalian maRali raodenobrivi Sefaseba saSualo 100% informacia struqturis Sesaxeb ki ara sakvlevi obieqtis raodenoba dabali, saSualo, maRali Zalian maRali kvlevisaTvis saWiro dro dReebi, kvirebi 30 wT, 2 sT, dReebi fasi saSualo maRali

41 ISH-Tvis saWiro instrumentebi

42